تحقیق دانشگاهی – بررسی اثر ژل آلوئه ورا بر روی فاکتورهای اسپرمی و تغییرات هیستوشیمیایی …

وزن هرگروه X
سپس دوزمربوطه ازSTZ ، (X) را که به صورت پودر بوده و برای تزریق داخل صفاقی باید به صورت محلول تبدیل می شد،درآوردیم، بدین منظور از محلول بافری سیترات سدیم ۱/۰ مولار با ۵/۴ PH (متشکل از سیترات سدیم مونوهیدراته و اسید سیترریک ) برای حل کردن استرپتوزوتوسین استفاده شد. به منظور القای دیابت تجربی نوع I ،ابتدا موش ها به مدت ۱۲ ساعت ناشتا نگه داشته شدند پس از وزن کردن موش های ناشتا ، ناحیه تزریق توسط الکل ضد عفونی شده و سپس تزریق استرپتوزوتوسین توسط سرنگ انسولین انجام شد پس از تزر یقSTZ به میزان ۶۰ میلی گرم موش ها به ظرف نگهداری منتقل شدند و غذا در اختیار آنها قرار گرفت برای جلوگیری از هایپوگلایسمی ناگهانی که ممکن است بعد از تزریق استرپتوزوتوسین ایجاد شود به مدت ۲۴ ساعت از گلوکز ۲۰% به جای آب استفاده شد.علائم دیابت شامل پرنوشی ،پرادراری وکاهش وزن پس ازگذشت ۳روز ظاهرشد. برای حصول اطمینان از ایجاد دیابت میزان قند خون ناشتای این حیوانات باخون گیری دمی ولانست زدن مستقیم از دم حیوان توسط دستگاه گلوکومتر الگانس( (Elegance CT- Germany) اندازه گیری وکنترل شد .ملاک دیابتی شدن افزایش میزان گلوکز خون بین mg/dl 300- 200در نظر گرفته شد.موش هایی که قند خون آنها بیشتر از mg/dl 200 بود دیابتی محسوب شده و مورد استفاده قرار گرفتند.) (Dhanda paniet al,2002
۲-۳ نحوه اندازه گیری قند خون
برای اندازه گیری قند خون ابتدا دم حیوان را به منظور پر خون شدن ورید دمی در آب گرم قرار داده بعد از خشک کردن دم توسط تامپون آن را با پنبه آغشته با الکل سفید پاک کرده و سپس ازطریق سیاهرگ دمی وبا لانست زدن مستقیم از دم حیوان وتوسط دستگاه گلوکومتر انجام گرفت .خون گیری مرحله آخر نیز پس از کالبدشکافی ونمایان شدن قلب ،با استفاده ازسرنگ های cc5 آغشته به ماده ضد انعقاد هپارین ازبطن چپ قلب انجام گرفت.خون حاصله در لوله های آزمایش ریخته شد وجهت انجام آزمایشات بیوشیمیایی به آزمایشگاه منتقل شد.خون های جمع آوری شده با۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شده وسرم آن جدا شده وتا زمان انجام آزمایشات بیوشیمیایی درفریزر۸۰ – نگهداری شد. اندازه گیری قندخون در شروع دوره(قبل ازشروع بررسی ها)،هفته اول، روز بیست وهشت و در پایان دوره انجام شد.
۲-۴- نحوه تهیه ژل گیاهی
دراین تحقیق از ژل گیاه آلوئه ورا ازگونه ی Barbadensis Miller استفاده شد که توسط شرکت داروسازی باریج اسانس ایران تهیه وخریداری شد.که این شرکت طبق سفارش وبه منظور حفظ فلاونوئید ها وترکیبات ژل ازهیچ گونه عامل حرارتی در تهیه ژل مذکور استفاده نکرده بود .ازقطعات ژل هرروز به مقدار مشخص وزن ودر نرمال سالین حل شده و به مدت ۵۶ روز به صورت خوراکی ،روزانه به موش ها خورانده شد. Hosseinifar,2011)).
۲-۵- نحوه تجویز عصاره به حیوان
برای انجام این کار مقدار مورد نظر ژل با ترازوی دیجیتالی وزن شده و سپس در ۱/۰ میلی لیتر نرمال سالین حل شد و با دستگاه اولتراسوند به یک حالت همگن تبدیل شد. سپس ژل توسط سرنگی که سر آن به سوند گاواژ متصل بود به حیوان خورانده شد .
۲-۶-نمونه برداری:
رتهای متعلق به گروه های مختلف آزمایشی پس از طی دورهی زمانی ۵۶ روز ابتدا وزن شده ،سپس بوسیله تزریق ترکیب زایلازین و کتامین به صورت داخل صفاقی بیهوش شدند سپس آسان کشی شده و نمونه خونی از قلب رتها برای اندازه گیری میزان هورمون تستوسترون جمع آوری شد.سپس جهت استحصال سرم، نمونه ها در سانتریفوژ به مدت ۵ دقیقه با سرعت ۳۰۰۰ دور در دقیقه قرار داده شدند. پس از باز نمودن شکم، بیضه ها از محوطه بطنی خارج شده و در زیر لوپ با بزرگنمایی ۲۰، بافت های همبنداطراف برداشته شده و بیضه ها توسط ترازوی دیجیتال با دقت یک هزارم گرم وزن شدند. در نهایت بیضه های یک طرف جهت ثبوت به محلول ثبوتی فرمالین ۱۰ درصد منتقل شدند. و بیضه های طرف دیگر بلافاصله به مدت ۱۰ دقیقه درتماس با بخار نیتروژن مایع قرارگرفته وسزیعاًبه دمای۷۰- درجه سانتی گراد جهت نگهداری به منظور ارزیابی های بعدی بیوشیمیایی انتقال داده شد.
۲-۷-بررسی قابلیت باروری آزمایشگاهی (IVF)
۳-۷-۱-آماده سازی اسپرم ها برای باروری آزمایشگاهی
اسپرم ها با رعایت شرایط استریل به روشی که در بالا اشاره شد جمع آوری شدند. پس از شستشو (Swim-up) سوسپانسیون محتوی اسپرم ها به مدت ۳ ساعت در انکوباتور CO2 انکوبه شدند (۳۵ درجه سانتی گراد، ۵ درصد CO2 ) ودمای ۳۷ درجه قرار داده شدند.برای ارزیابی توان باروری اسپرم های رسوب کرده در ته تیوب و در ضمن برای برآورد توان باروری اسپرم های سطحی، دو سری اسپرم برداری صورت گرفت. بدین صورت که ۱/۰ میلی لیتر از اسپرم های سطح تیوب و ۱/۰ میلی لیتر از اسپرم های ته نشین شده در انتهای تیوب برداشته شدند (Suzuki & Sofikitis, 1999).اسپرم ها با رعایت شرایط استریل به روشی که قبلا به آن اشاره شد جمع آوری شدند. سپس سوسپانسیون محتوی اسپرم ها به مدت ۵ ساعت جهت ظرفیت یابی در انکوباتور CO2 %۵ و دمای ۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده شدند.
۲-۷-۲-آماده سازی محیط کشت برای IVF
عصر روز قبل از عمل IVF محیط کشت لازم در انکوباتور ۲CO با غلظت %۵ و دمای ۳۷ درجه سانتیگراد تهیه ونگهداری شد. از محیط کشت mR1ECM یک قطره ۵۰۰ میکرولیتری در هر دیش برای لقاح و چندین قطره ۱۵۰ میکرولیتری برای شستشو در دیش های لقاح قرار داده و سپس دیش های حاوی قطره لقاح و شستشو توسط روغن معدنی[۶۳] پوشانده شدند. تخمکها در داخل قطره لقاح قرار گرفته و سپس اسپرم های قبلا به توانایی رسیده به تعداد یک میلیون اسپرم به ازای هر میلی لیتر به محیط کشت اضافه گردید. بعد از گذشت ۶ ساعت درصد باروری تخمکها در زیرمیکروسکوپ اینورت مورد مطالعه قرار گرفت و تخمکهای بارور شده (زیگو ت ها) بعد از شستشو به محیط کشت تازه تهیه شده انتقال یافتند. در ضمن در صد جنینهای دو سلولی بعد از گذشت ۲۴ ساعت و در صد بلاستوسیستها در روز چهارم و پنجم نیز مورد بررسی قرار گرفتند (Suckow et al, 2006).
۳-۷-۳- طرز تهیه محیط کشت جنین (mR1ECM)
این محیط از اختلاط دو استوک A و B تهیه می گردد که طرز تهیه آن ها به صورت زیر می باشد:
استوک A: 42/6 گرم کلرید سدیم، ۲۳۹/۰ گرم کلرید پتاسیم، ۳۵۲/۱ گرم گلوکوز، ۰۷۵/۰ گرم پنیسیلین جی، ۰۵۰/۰ گرم استرپتومایسن و ۹/۱ سی سی لاکتات سدیم را در ۱۰۰ سی سی آب سه بار تقطیر حل کرده و سپس با استفاده از فیلتر ۲۰/۰ میکرمتر فیلتر نموده و تحت عنوان استوک A به یخچال ۴ درجه سانتیگراد انتقال یافت.
استوک B: 294/0 گرم کلریدکلسیم و ۱۰۲/۰ گرم کلرید منیزیم را در ۱۰۰ سی سی آب سه بار تقطیر حل کرده و بعد از فیلتر کردن توسط فیلتر ۲۰/۰ میکرومتر به یخچال ۴ درجه انتقال یافت.سپس در داخل یک فلاسک محیط کشت، ۱۰ سی سی از استوک A و ۱۰ سی سی از استوکB مخلوط شده و به این مخلوط ۲۱۰/۰ گرم بیکربنات سدیم ، ۰۰۵۵/۰ گرم پیرووات سدیم، ۰۱۴۶/۰ گرم گلوتامین ال، دو سی سی اسیدهای امینه ضروری و یک سی سی اسید های آمینه غیرضروری اضافه می شود و با آب سه بار تقطیر حجم محلول مورد نظر به ۱۰۰ سی سی می رسانیم و محیط مربوط را با فیلتر ۲۰ میکرومتر فیلتر می کنیم که محلول آماده استفاده است. لازم به ذکر است که اسمولالیته محیط در حدود mOsm[64] ۳۱۰ تنظیم گردید (She-hoon et al,1998)
۲-۷-۴تخمک گیری از رتهای ماده
به رتها ابتدا ۱۵ واحد PMSG (ساخت شرکت Folligon کشور هلند) از طریق تزریق داخل صفاقی تزریق شد، بعد از گذشت ۵۴ ساعت، ۱۵ واحد هورمون HCG (ساخت شرکت Folligon کشور هلند) به روش تزریق داخل صفاقی تزریق شد. سپس تخمک ها بعد از گذشت ۱۰ ساعت از تزریق HCG توسط روش دیسکت از ناحیه آمپول اوویدوکت جمع آوری شدند(Suckow et al ,2006)
۲-۷-۵- عمل لقاح
اسپرم های ظرفیت یابی شده( به میزان ۱۰۶×۱عدد) به قطره محیط کشت حاوی تخمک های شستشو یافته انتقال داده شد.لازم به ذکر است که قبلا توسط پیپت پاستور شیشه ای با عمل پیپتینگ اووسیت های همراه توده کومولوسی از هم جدا شده بودند. عمل لقاح حدود ۶-۸ ساعت پس از اضافه کردن اسپرم با مشاهده دو پیش هسته نر و ماده مشخص شد. در این حالت تخمک لقاح یافته را شستشو داده و به محیط کشت جدید (mR1ECM)منتقل گردید(Suckow et al ,2006).
۲-۷-۶-ارزیابی رشد جنین ها
تخمکها در داخل قطره لقاح قرار گرفته و سپس اسپرم های قبلا به توانایی رسیده به تعداد یک میلیون اسپرم به ازای هر میلی لیتر به محیط کشت اضافه گردید. بعد از گذشت ۶ ساعت درصد باروری تخمکها در زیرمیکروسکوپ اینورت مورد مطالعه قرار گرفت و تخمکهای بارور شده (زیگو ت ها) بعد از شستشو به محیط کشت تازه تهیه شده انتقال یافتند. در ضمن در صد جنینهای دو سلولی بعد از گذشت ۲۴ ساعت و در صد بلاستوسیستها در روز چهار الی پنج نیز مورد بررسی قرار گرفتند (Suckow et al, 2006).
۲-۸-نحوه استحصال اسپرم از اپیدیدم
دم اپیدیدیم رت های گروههای مختلف تحت درمان و کنترل از بافت بیضه جداشد. متعاقباً درون یک میلی لیتر محیط کشت mR1ECM که امروزه به عنوان محیط کشت مناسب و اختصاصی برای رت در نظر گرفته شده است، قرار داده شدند برای جلوگیری از ایجاد شوک حرارتی وآسیب به اسپرم ها،تمام وسایل مورد استفاده ومحیط کشت قبل ازمصرف درانکوباتور ۳۷ درجه قرارداده شدند. چندین شکاف در دم اپیدیدیم ایجاد شد و پتری دیش حاوی دم اپیدیدیم به مدت ۳۰ دقیقه در انکوباتور ۲co , و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد باقی ماند تا اسپرمها بتوانند از دم اپیدیدیم خارج و وارد محیط کشت شوند. بعد از ۳۰ دقیقه قطعات بافتی از محیط برداشته شدند تا امکان خروج اسپرم ها ازاپی دیدم فراهم آید.درنهایت سوسپانسیون حاوی اسپرم با استفاده ازمحیط کشت به نسبت ۱ به ۲۰ رقیق گردید..et al ,1996) (seed.
۲-۹- شمارش اسپرم ها
برای شمارش اسپرم ها رقت ۱ به ۲۰ از اسپرم مذکور تهیه شد به این صورت که در داخل یک میکروتیوب ۱ میلی لیتری ۱۹۰ میکرولیتر آب مقطر ریخته شده و سپس ۱۰ میکرولیتر از اسپرم مورد نظر به آن افزوده شد سپس ۱۰ میکرولیتر از این محلول بر روی لام نئوبار (که لامل سنگی از قبل بر روی آن گذاشته شده بود) ریخته شد بدین ترتیب شمارش تعداد اسپرم ها انجام گرفت.اسپرم ها متعاقب سانتریفیوژ به مدت ۵ دقیقه با دور ۳۰۰۰ از محیط کشت جدا گردیدند. و سپس یک میلی لیتر محیط کشت mR1ECM تازه به سوسپانسیون اضافه گردید. سوسپانسیون حاصل برای آزمایشات بعدی توسط محیط کشت ۱ به ۲۰ رقیق سازی شده بود.به منظور شمارش تعداد اسپرمها از لام هموسیتومتر استفاده گردیدروش کار بدین صورت بود که یک قطره از محلول رقیق شده اسپرم بر روی لام هموسیتومتر قرار داده شد. به منظور شمارش بهتر تعداد اسپرمها ،لام به مدت پنج دقیقه بدون حرکت گذاشته شد تا تحرک اسپرمها کاهش یابد. سپس تعداد اسپرمها در هر پنج مربع بزرگ لام نئوبار شمارش شد. با استفاده از فرمول(d ×۵۰۰۰۰× n = تعداد کل اسپرمهای شمارش شده در هر میلی لیتر محیط کشت محاسبه گردیدn.=تعداد کل اسپرمهای شمارش شده در پنج مربع لام نئوبار.
d= عکس رقت سوسپانسیون تهیه شده حاوی اسپرم ( .(WHO Laboratory Manual
۲-۱۰ بررسی قدرت زیست پذیری اسپرم
برای ارزیابی درصد اسپرم های زنده و همچنین تشخیص اسپرم های زنده از اسپرم های مرده از روش رنگ آمیزی ائوزین-نگروزین استفاده شد. ابتدا یک قطره از محیط کشت حاوی اسپرم و یک قطره از رنگ ائوزین را روی یک لام تمیز قرار داده، بعد آنها را با هم مخلوط کرده و بعد از گذشت ۳۰ ثانیه یک قطره نگروزین به آن اضافه کرده و اسمیرتهیه گردیده و بعد از خشک شدن در دمای آزمایشگاه، در صد اسپرمهای زنده در زیر میکروسکوپ نوری بدست آمد. اصول این کار بر این نکته استوار است که در اثر آسیب به غشاء پلاسمایی، اسپرم ها در برابر رنگ مذکور نفوذ پذیر می شوند. لذا آن دسته از اسپرم هایی که هر یک از قطعات سر، گردن و یا دم آنها رنگ گرفته بود به عنوان اسپرم های مرده اطلاق شدند نتایج در قالب درصد بیان شدند( رضا زاده، ۱۳۸۱). تعداد ۲۰۰ اسپرم برای هر نمونه با درشت نمایی ۴۰۰ برابر مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاصل در قالب درصد اسپرم های زنده بیان شدند ( .(WHO Laboratory Manual
۲-۱۱- ارزیابی کیفیت کروماتین/DNA اسپرم توسط رنگ آمیزی آنیلین بلو (AB)
پروتئین هیستون دارای تعداد زیادی اسید آمینه لیزین می باشد که با رنگ های اسیدی همانند AB واکنش می دهد و آبی رنگ می شود. بنابراین اسپرم هایی که پس از ایجاد تراکم در کروماتین خود دارای هیستون اضافی می باشند با این رنگ آمیزی مشخص می شوند.( Erenpreiss et al, 2001).برای انجام این تست پس از تهیه اسمیر از هر نمونه حیوانی و خشک شدن در هوا،توسط فیکساتیو گلوتارآلدهید ۳% به مدت ۳۰ دقیقه عمل ثابت شدن صورت پذیرد. در مرحله بعد نمونه ها توسط محلول ۵% آنیلین بلو در اسید استیک ۴% به مدت ۵-۸ دقیقه رنگ آمیزی شدند. سپس لامها را با میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفتندو با شمارش پنج اسلاید برای هر رت و صد عدد اسپرم در هر اسلاید، تعداد اسپرم های با سر بی رنگ (بالغ) و سر آبی رنگ (نابالغ) در هر نمونه تعیین گردید. ( Nasr- Esfahani et al, 2001)
۲-۱۲- بررسی میزان آسیب DNA اسپرم
رنگ آمیزی آکریدین اورنج(AO)
این رنگ فلوروسنت جهت تمایز DNA دو رشته ای سالم از DNA تک رشته ای دناتوره شده به کار می رود. AO با DNA سالم زیر میکروسکوپ فلوروسنت سبز رنگ و با DNA تک رشته ای دناتوره زرد تا قرمز رنگ می شود.پس از تهیه اسمیر و خشک نمودن در هوا فیکساسیون اسمیرها توسط محلول کارنوی (متانول-اسید استیک با نسبت۳:۱) به مدت حداقل دو ساعت انجام گرفت و سپس رنگ AO تازه با غلظت mg19/0 در بافر سیترات فسفات به مدت ۱۰ دقیقه بر روی لام ریخته شد. پس از شستشوی لامها توسط آب جاری وقرار دادن لامل بر روی آنها، توسط میکروسکوپ فلوروسنت با فیلتر nm460 بررسی شد(.(Erenpreiss et al ,2001
۲-۱۳ آزمایشات بیوشیمیایی سرم
اندازه گیری میزان سرمی تستوسترون
نمونه های خون رتهای گروه های مختلف آزمایشی در روزهای ۱۵و ۳۰ و ۴۵ مستقیماً از قلب این حیوانات گرفته شد و پس از سانتریفیوژ نمونه ها در ۳۰۰۰ دور به مدت ۵ دقیقه سرم جدا شد و در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد تا زمان انجام آنالیز هورمونی نگهداری شد. برای اندازه گیری تستوسترون با روش الایزا (ELISA)[65] با استفاده از کیت با مشخصه (Demeditec Diagnostics GmbH, Kiel, Germany) انجام شد.
۲-۱۴-آزمایش بیوشیمیایی بافت بیضه
۲-۱۴-۱-اندازه گیری میزان مالون دی-آلدئید (MDA)[66] بافت بیضه

این مطلب را هم بخوانید :  بررسی حلالیت تارتاریک اسید با استفاده از نانو ذرات نقره- قسمت ۵

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت zusa.ir مراجعه نمایید.