متن کامل – بررسی اثر ژل آلوئه ورا بر روی فاکتورهای اسپرمی و تغییرات هیستوشیمیایی بیضه …

طرز تهیه بافر :
محلول ۱ :
۵۰۴۰/۱ گرم از NaH2PO4 را وزن نموده و ۱۷۹۰/۲ گرم از Na2HPOرا برداشته در بالن ۱۰۰ ریخته به حجم می رسانیم PH را روی ۴/۷ تنظیم می کنیم .
محلول ۲ :
۱۰ گرم TCA را در یک بالن ۱۰۰ با آب مقطر به حجم میرسانیم .
محلول ۳ :
۶۷/۰ گرم از TBA را در بالن ۱۰۰ ریخته و به حجم میرسانیم .
نمونه را وزن نموده و ۱۰% وزنی حجمی در آن بافر فسفات می ریزیم در هاون کوبیده ودر مدت ۵ دقیقه در دور ۱۰۰۰ سانتریفوژ کرده سپس ۱۵۰ مایکرولیتر از نمونه رویی را برداشته در میکروتیوپ می ریزیم و ۳۰۰ مایکرولیتر TCA 10% به آن اضافه نموده و به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۰۰۰ در دمای ۴ درجه سانتریفوژ کردیم .
۳۰۰ مایکرولیتر از محلول رویی را به لوله آزمایش منتقل نموده و با ۳۰۰ مایکرولیتر از TBA 67% در دمای ۱۰۰ سانتی گراد برای مدت ۲۵ دقیقه آنکوبه نمودیم .
۵ دقیقه بعد از خنک شدن محلول رنگی صورتی ناشی از واکنش MDA-TBA ظاهر و به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۳۵ نانومتر ارزیابی نمودیم . (Hosseinzadehand sadeghnia,2005).
۲-۱۴-۲-سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز:
.برای این منظور از پراکسیدهیدروژن ۳۰ میلی مولار به عنوان سوبسترا و از بافرفسفات ۵۰ میلی مولار با (PH=7) به عنوان جایگزین سوبسترا در محلول بلانک استفاده شد .محلول سنجش محتوی ۲ میلی لیتر محلول هموژنای بافتی و ۱ میلی لیتر محلول پراکسیدهیدروژن بود .واکنش با افزودن H2O2 شروع شده و کاهش در جذب به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج ۲۴۰ نانومتر به مدت ۳۰ ثانیه بررسی گردیده و در پایان مقادیر بر حسب tissue U/gr بیان گردید. ( Aebi ,1984)..
۲-۱۴-۳-اندازه گیری میزان ظرفیت آنتی اکسیدانی تام[۶۷](TAOC) در بافت بیضه :
آنتی اکسیدانت ها ،مولکول هایی هستند که قادرند تا اکسیداسیون دیگر مولکول ها را کند کرده و یا از آن جلوگیری کنند .آنتی اکسیدانت ها می توانند واسطه های رادیکال آزاد را حذف کرده و واکنش پذیری اکسیدانت های دیگر را توسط اکسید شدن خودشان ، مهار کنند.یک تست ساده و به صورت خودکار اندازه گیری و ارزیابی آنتی اکسیدانت ، تست ferric reducing antioxidant power می باشد .کاهش یون فریک به فروس در PH پایین باعث تشکیل یک کمپلکس رنگی ferrous –tripyridytrizine می شود . ارزش و مقدار FRAP توسط مقایسه کردن تغییر جذب در ۵۹۳ nm در مخلوط واکنشی تست با مخلوط شامل یون فروس با غلظت مشخص به دست می آید . به طور بالقوه ROS مضر به عنوان یک نتیجه متابولیسم هوازی نرمال تولید می شود .این رادیکال های آزاد معمولا در invivo توسط گروهی از آنتی اکسیدانت ها حذف و یا غیر فعال می شوند .در PH پایین ، هنگامی که کمپلکس FeШ-TPTZ به فرم فروس (Feп) کاهش می یابد ، یک رنگ آبی شدید با یک جذب بالا در ۵۹۳nm ایجاد می کند .شرایط برای کاهش مطلوب کمپلکس و بنابراین توسعه و پیشرفت رنگ ،فراهم می شود در صورتیکه ردوکتانت (آنتی اکسیدانت )حضور داشته باشند(Iris and strain ,1996).
محلول استاندارد Feп ۱۰۰ به ۲۰۰۰ میلی مول از فروس سولفات Feso4.7H2o2 در آب مقطر آماده می شود .داده ها بر اساس میلی مول وزن بافت بیان می شود (FRAP value) (Hosseinzadeh and sadeghnia ,2005; Hosseinzadeh and sadeghnia ,2005a ; Iris and strain ,1996 ).
۲-۱۵-بررسی بافت بیضه
روش تهیه مقاطع بافتی بیضه
در این مرحله از کار نمونه های بافتی به مدت ۷۲-۴۸ ساعت در محلول ثبوتی فرمالین – سرم فیزیولوژی قرار داده شدند فرمول محلول ثبوتی فرمالین – سرم فیزیولوژی به قرار زیر است
آلدئید فرمیک تجاری: ۱۰۰ میلی لیتر
کلرور سدیم : ۹ گرم
آب مقطر : ۹۰۰ میلی لیتر
پس از تثبیت نمونه ها مراحل مختلف طی گردید که عبارتند از
آبگیری
بافت تثبیت شده مقدار زیادی آب دارد که می توان موجب اختلال در انجام مراحل تهیه مقطع شود آب موجود در بافت در طی مرحله آبگیری گرفته می شود در این مرحله نمونه ها با استفاده از الکل اتیلیک آبگیری می شوند بدین منظور از الکل اتیلیک با غلظتهای صعودی استفاده می شود که به ترتیب شامل الکل ۷۰و ۸۰و ۹۰ و دو ظرف الکل مطلق می باشند مدت زمان لازم برای قرار دادن نمونه ها در هر ظرف در داخل انکوباتور حدود ۱ ساعت است
شفاف سازی
الکل اتیلیک قابلیت اختلاط با پارافین مذاب را ندارد بنابراین بافت آبگیری شده قبل از مرحله آغشتگی در ظرف محتوای گزیلول به مدت ۳۰ دقیقه (در داخل انکوباتور) و در ظرف محتوای روغن سدر از شب تا صبح (در خارج از انکوباتور) قرار داده شد .
آغشتگی با پارافین
قبل از قرار گرفتن در پارافین نمونه ها به مدت ۳۰ دقیقه در گزیلول (در داخل انکوباتور) قرار داده شدند و پس از آن در ۳ ظرف حاوی پارافین مذاب ۵۶-۵۵ درجه سانتی گراد(در داخل انکوباتور) قرار گرفتند پس از ۴ ساعت نمونه ها از پارافین خارج شدند
مجموعه این سه مرحله پاساژ بافت نامیده می شود
قالب گیری
پس از طی مراحل پاساژ بافت نمونه ها با استفاده از پارافین مذاب قالب گیری شدند نمونه بافتی از سطحی که برای برش در نظر گرفته شده بود در قالب قرار داده شده و سپس پارافین مذاب درون قالب ریخته شد پس از سرد شدن پارافین و منجمد شدن آن قالب ها جدا شدند.
برش بافتی
بعد از مرحله قالب گیری و جدا کردن قالب ها اقدام به برش بافتی گردید بدین منظور با استفاده از دستگاه میکروتوم برش هایی با ضخامت ۶ میکرون تهیه شده و در بن ماری ۵۰ درجه سانتی گراد قرار داده شدند سپس با استفاده از لام های آغشته به چسب آلبومین، نمونه های مورد نظر از سطح آب برداشته شدند لام ها حداقل به مدت ۲۴ ساعت در هوای آزمایشگاه باقی ماندند تا کاملا خشک شوند بدین ترتیب نمونه های بافتی برای انجام رنگ آمیزی و مطالعات بافتی آماده شدند.
۲-۱۶ رنگ آمیزی
برای رنگ آمیزی برش های بافتی از رنگ های هماتوکسیلین، ائوزین وآهن وایگرت استفاده شد.
۲-۱۶-۱ رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین
هماتوکسیلین و ائوزین به ترتیب برای رنگ آمیزی هسته و سیتوپلاسم به کار می روند مواد لازم در این رنگ آمیزی عبارتند از
گزیلول
الکل اتیلیک با غلظت های ۷۰ درصد تا مطلق
اسید الکل
محلول اشباع کربنات لیتیوم
رنگ هماتوکسیلین

این مطلب را هم بخوانید :  یکپارچه سازی زنجیره تأمین و جهت گیری بازار و اثرات آنان بر عملکرد شرکت- قسمت ۲۱

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت  jemo.ir  مراجعه نمایید.