شناسایی جهش در ژن آنژیوتانسین بیماران مبتلا به آترواسکلروزیس مراجعه کننده به بیمارستان …

شواهدی از تولید آنژیوتانسین داخل سلولی در دسترس نیست. مطالعات بر روی رنین و پرورنین۶ انجام گرفته، نشان می دهد که رنین و پرورنین به داخل سلول وارد می شوند (۴۱).
شکل (۱-۷) یک طرح پیشنهادی برای تولید آنژیوتانسین ۱و۲ در قلب را نمایش می دهد.
شکل ۱-۶ : طرح پیشنهادی تولید آنژیوتنسین ۱ و ۲ در قلب (۴۱).
قسمت های داخل رگ و درون شکاف و سلول های قلبی را نشان داده است . رنین و آنژیوتانسینوژن در حال گردش وارد شکاف می گردد رنین ممکن است به دیواره رگ و سلول های قلبی متصل گردد .ACE روی سلول های اندوتلیال و سلول های قلبی حضور دارند . AngI و AngII به وسیله پپتیدازها در آن طرف رگ تغییر یافته .AngI وAngII در جریان بین شکاف و خارج از جریان شریان ایجاد می گردد . AngI وAngII بافتی ممکن است فقط در جریان بین شکاف یا روی سطح سلول تولید نگردد برای نمونه بعد از جذب رنین به وسیله سلول ها تولید می گردد.
۱-۱۲ تاثیرات RAASروی سلول های قلبی:
قلب دارای شمار زیادی از رسپتورهای آنژیوتانسین ۲ است آنژیوتانسین ۲ مسیرهای انتقال پیام در ماهیچهی قلب را افزایش داده که تاثیرات آن شامل، بزرگ شدن سلول قلبی که با بزرگ شدن بطن[۳۵] چپ، آپوپتوز در فیبروبلاست ها ، کاهش کلاژن درفیبرهای ماهیچه ای و فیبروس در بافت قلبی مشاهده شده است (۴۲).
۱- ۱۳ تاثیرات RAAS روی جریان کرونری:
آنژیوتانسین ۲، انقباض شریان، انبساط دیوارۀ شریان، تشکیل پلاک های آترواسکلروزیس، التهاب بافتی، ایجاد لخته در جریان کرونری را افزایش می دهد (۴۲).
آنژیوتانسین ۲ به طور مستقیم، حتی در غیاب فشارخون بالا یا افزایش کلسترول، ایجاد آترواسکلروزیس می کند (۴۲).
تاثیرات آترواسکلروزیس با آنژیوتانسین۲، با فعالیت سیتوکاین های التهابی، پروتئین های جاذب منوسیت و ملکول های چسبندگی ایجاد می گردد. بیان مهارکنندۀ فعالیت پلاسمینوژن ۱ (PAI-1)[36] که تولید اولیه لخته می کند از فعالیت تخریب فیبرین طبیعی با فعالیت پلاسمینوژن بافتی جلوگیری می کند (۴۲).
۱- ۱۴ تاثیرات RAAS روی جریان منظم شریان:
فعالیت RAAS به طور مستقیم با افزایش فشارخون، سبب انقباض و افزایش غیرعادی سلول های ماهیچه ای صاف می شود که سیستم عصب سمپاتیک را تحریک کرده که باعث ترشح رنین می شود (۴۲).
فعالیت اکسید نیتریک، اتساع عروق و بزرگ شدن شریان را مهار می کند. و تغییردهندهی تاثیرات آنژیوتانسین ۲ و کتکول آمین ها و اندوتلین است. در وضعیت بیماری تولید آنژیوتانسین ۲ باعث از دست رفتن اکسید نیتریک شده و سلول های اندوتلیال شریان آسیب می بینند (۴۲).
Ang2 تولید آلدوسترون کرده که سبب افزایش فشارخون و آسیب های شریان می شود. آلدوسترون باز جذب سدیم از کلیه و دفع پتاسیم را پیش می برد. آلدوسترون در التهاب، پروتئین ادراری و فیبروس درگیر است (۴۲). آلدوسترون تاثیرات Ang2 را افزایش داده و موجب ایجاد گونه های اکسیژن رادیواکتیو می گردد در شکل (۱-۸) تاثیرات آنژیوتانسین ۲ بر روی قلب را نشان داده است (۴۲).
شکل ۱-۷ : تاثیرات آنژیوتانسین ۲ روی قلب (۴۲).
۱-۱۵ جداسازی و خالص سازی DNA از سلول:
اولین قدم در مهندسی ژنتیک جداسازی و خالص سازی DNA و RNA است که این کار دارای مراحلی است (۷۹) .
الف) شکستن سلول:
از آنجایی که DNA و RNA در داخل سلول قرار دارند جهت جداسازی آنها ابتدا باید سلول را شکت سلول های جانوری را معمولا با استفاده از شوک اسمزی و یا دترجنت های یونی مانند SDS (سدیم دو دسیل سولفات) و سلول های گیاهی را به دلیل داشتن دیوارۀ سخت پکتینی و سلولزی با استفاده از آنزیم های پکتیناز و سلولاز می شکنند (۷۹).
به دلیل شکنندگی رشته های DNA و RNA شکستن سلول ها باید در داخل بافر انجام گیرد این بافر شامل Tris HCL و SDS است SDS دو خاصیت دارد: یکی باعث حل شدن چربی ها می شود و دیگر این که با اتصال به DNA باعث پایداری آن می شود (۷۹).
ب ) رسوب دادن DNA وRNA:
با شکسته شدن سلول، محتویات آن که شامل DNA و RNA و پروتئین و چربی و قند و غیره است آزاد می شود. در مرحلۀ بعد باید DNA وRNA را خالص کرده ، برای این کار از الکل استفاده می شود الکل سرد را به سوسپانسیون حاصل از شکستن سلول اضافه می کنند و در فریزر قرار می دهند در این مرحله در حد فاصل آب و آلکل ،DNA و RNA رسوب می کنند (۷۹).
ج ) جداکردن DNA و RNA:
برای این کار از میلۀ شیشه ای استفاده می شود به این صورت که میله را به آرامی داخل لوله فرو برده و می چرخانند، رشته های DNA و RNA به دور میلۀ شیشه ای می چسبند سپس میلۀ را به آرامی خارج می کنند و در لوله دیگر محتوی بافر فرو برده و تکان می دهند تا DNA وRNA دوباره در بافر حل شوند این مرحله باید به ملایمت صورت گیرد تا DNA و RNA نشکنند (۷۹).
د ) رسوب پروتئین ها:
DNA و RNA حاصل از مرحلۀ قبل هر چقدر هم که خالص باشند ولی باز هم حاوی کمی پروتئین خواهند بود در این مرحله برای خالص کردن DNA وRNA باید پروتئین ها را رسوب دهیم برای این کار از فنل و یا محلول غلیظ نمک های مختلف استفاده می کنند این مواد باعث تغییر شکل پروتئین ها در نتیجۀ رسوب آن ها می شود (۷۹).
ه ) جدا کردن DNA وRNA از یکدیگر:
در این مرحله با توجه به کاری که مدنظر است DNA از RNA جدا می شود اگر هدف بررسی DNA باشد با استفاده از آنزیم RNase، RNA ها را تجزیه می کنند و اگر بخواهند RNA را بررسی کنیم آنزیم DNase استفاده می کنند (۷۹).
ر ) رسوب با اتر:
با استفاده از اتر DNA یا RNA باقی مانده را رسوب می دهند اثر تمامی رشته های باقی مانده را رسوب می دهند سپس این رسوب را برای مطالعات بعدی به کار می رود (۷۹).
۱-۱۶ واکنش زنجیرۀ پلی مراز:
واکنش زنجیره پلی مراز [۳۷](PCR) جانشینی برای کلون کردن به منظور ایجاد مقادیر نامحدود از یک توالی مورد نظر می باشد (۷۸).
PCR به طور انتخابی می تواند یک ملکول منفرد از DNA یا RNA چندین بیلیون بار در مدت چند ساعت افزایش دهد و این روش در تشخیص ملکولی و هم در آنالیز ملکولی بیماری ژنتیکی انقلابی به وجود آورده است (۷۸).
PCR یک روش افزایش آنزیمی یک قطعه از DNA است که بین دو بخش الیگونوکلئوتیدی قرار دارد این بخش ها چنان طراحی شده اند که یکی از آنها مکمل یک رشته از ملکول DNA در یک سمت توالی هدف بوده و دیگری مکمل رشته دیگر ملکول DNAدر سمت مخالف توالی هدف می باشد. از آنجایی که انتهای َ۳هر کدام از الیگونوکلئوتیدها به سمت توالی هدفی که باید افزایش یابد قرار دارد و این قطعات آغازین در جوانب توالی هدف قرار دارند قطعات آغازین در اثر سنتز توالی بین آنها توسط DNA پلی مراز کشیده می شوند. پرایمرها چنان ترتیب یافته اند که دو رشته جدید DNA را خودشان مکمل بوده و لزومـا یک نسخه دوم از توالی هدف اولیه ایجاد می کنند را پر می نمایند. چرخه های تکراری دناتوراسیون حرارتی، هیبریداسیون پرایمرها، و سنتز آنزیمی DNA منجر به افزایش نهایی توالی هدف DNA می شود (۷۸).
۱-۱۶-۱ مراحل اصلی در واکنش زنجیرۀ پلی مراز:
مخلوط تا C˚۹۴ حرارت داده می‌شود. این دما، پیوندهای هیدروژنی نگهدارنده دو رشته DNA دو رشته ای را می‌شکند و باعث دناتوره [۳۸]شدن مولکول می‌گردد (۷۹).
مخلوط تا دمای C˚۶۰-۵۰ خنک می‌شود. در این دما دو رشته هر مولکول می‌توانند دوباره به یکدیگر متصل شوند، ولی عمدتا این اتفاق نمی‌افتد، چرا که مخلوط واکنش حاوی مقدار بسیار بیشتری از یکسری مولکول‌های کوچک DNA به نام الیگونوکلئوتید یا پرایمر است که در محل‌های ویژه ای به مولکول‌های DNA اتصال می‌یابند (۷۹).

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت  fotka.ir  مراجعه نمایید.

Share