شناسایی جهش در ژن آنژیوتانسین بیماران مبتلا به آترواسکلروزیس مراجعه کننده به بیمارستان افشار یزد۹۲- قسمت …

۲- ۱ مشخصات بیماران:
این مطالعه بر روی ۷۰ بیمار مبتلا به آترواسکلروزیس با گرفتگی عروق بیش از ۵۰% و ۷۰ فرد سالم انجام گرفت. تمام افراد مورد مطالعه در این تحقیق در محدوده سنی ۳۰ تا ۵۰ سال بودند و تشخیص اولیه بیماری در بیمارستان افشار یزد صورت گرفت. از نمونه های خون استخراج DNA صورت گرفت. سپس از این DNA برای واکنش PCR استفاده شد. برای ردیابی تغییرات از تکنیک SSCP استفاده شده و در نهایت برای تعیین این تغییرات تعیین توالی صورت گرفت.
جدول۲-۱: مشخصات بیماران
۲- ۲ بافرها و محلول ها:
۲-۲-۱ EDTA( PH:8وo.5):
در تهیه این محلول، ۱/۱۸۶ گرم EDTA .H2o دی سدیم با ۸۰۰ میلی لیتر آب مخلوط کرده سپس این مخلوط به روی دستگاه Hot plate stirrer منتقل شده تا کاملا مخلوط گردد و با استفاده از NaOH، PH محلول را به ۸ می رسانیم و قبل از استفاده اتوکلاوه می کنیم.
۲-۲ -۲ الکل ۷۵/.:
۱/۷۸ میلی لیتر از اتانول ۹۶% را با آب دو بار تقطیر به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم.
۲-۲-۳ پرایمر ها:
از هر کدام از پرایمر های استوک Forward و Reverse ، ۵/۲ میکرولیتر در میکروتیوپ های ۵/۱ میکرولیتری می ریزیم و با ۵/۴۷ میکرولیتر از آب تزریقی مخلوط کرده و در فریزر نگه داری می کنیم.
۲-۲-۴ اتیدیوم بروماید۱۰mg/ml:
۲/. گرم از ماده اتیدیوم بروماید در ۲۰ میلی لیتر آب دو بار تقطیر حل کرده و برای ژل الکتروفورز استفاده می کنیم.
۲-۲-۵ بافرTBE 10X:
برای تهیه این بافر ۸/۱۰ گرم تریس باز و ۵۵ گرم اسید بوریک در یک بشر می ریزیم سپس ۴۰ میلی لیتر EDATA o.5مولار با PH=8 به آن اضافه می کنیم و با آب دو بار تقطیر حجم محلول را به ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم. بشر را برای حل شدن محتویات آن به دستگاه Plate StirrerHot با دور ۳۰۰ منتقل می کنیم. سپس بافر را اتوکلاوه می کنیم.
۲-۲-۶ بافر TBE o.5x:
برای تهیه بافر TBE o.5x 30 میلی لیتر از بافر TBE 10x برداشته و سپس با آب اتوکلاو به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم .
۲-۲-۷ لودینگ بافر PCR:
شامل ۴۰ درصد ساکارز و هم چنین ۲۵o. درصد از هر کدام از رنگ های تشخیصی بروفنول بلو و زایلن سیانول می باشد. این بافر ویسکوزیته نمونه ها را افزایش داده و انتقال نمونه ها به چاهک ها را آسان می کند. افزایش چگالی نمونه ها به علت وجود گلیسرول است. هم چنین با ایجاد رنگ در نمونه انتقال آن مطمئن تر است . رنگ های مورد استفاده در این بافر خود دارای بار منفی هستند و به همراه نمونه به سمت آند حرکت می کنند. رنگ بروفنول بلو به علت کوچک بودن از ملکول DNA سریع تر حرکت کرده در حالی که زایلن سیانول سنگین بوده و کند تر حرکت می کند.
۲-۲-۸ لودینگ بافر SSCP:
برای تهیه این محلول، ۹۵/. فرمامید، ۵/. میلی گرم بروموفنل بلو و ۵/. میلی گرم زایلن سیانول استفاده شد. با توجه به اینکه رنگ های بروموفنول بلوزایلن سیانول به صورت محلول ذخیره mg/ml10 در EDTA o.5 M)) تهیه شده اند. برای ساخت لودینگ بافر ۵۰ میکرولیتر از هر کدام به فرمامید اضافه می گردد.
۲-۲-۹ تهیه محلول NaOH:
۵/۷ گرم پودر NaOH برداشته و با آب دو بار تقطیر به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم.
۲-۲-۱۰ تهیه محلول آمونیوم پرسولفات ۱۰٫/:
برای تهیه این محلول، ۱/. گرم از پودر آمونیوم پرسولفات در یک میکروویال ۵/۱ میکرولیتری ریخته شده و ۱۰۰۰ میکرولیتر آب دو بار تقطیر یا اتوکلاوه می ریزیم بهتر است برای هر بار استفاده تازه تهیه گردد. ولی در ۲۰- درجه تا یک ماه قابل استفاده است.
۲- ۳ کیت استخراج DNA:
از بافر A مقدار ۱۰۰۰ میکرولیتر به لولۀ میکروتیوپ ۵/۱ میکرولیتری انتقال داده ۲۰۰ میکرولیتر خون اضافه کرده و ۱۰ ثانیه ورتکس کرده و به مدت ۲۰ ثانیه با دور xg1000 سانتریفویژ کرده و محلول روی را دور ریخته (این مرحله را سه بار تکرار کرده).
به رسوب ۴۰۰ میکرولیتر بافر B اضافه نموده و به مدت ۲۰ ثانیه ورتکس می کنیم و نمونه به مدت ۵ دقیقه در حرارت آزمایشگاه قرار می دهند.
۲۰۰ میکرولیتر بافر C اضافه کرده و ده بار آن را سر و ته کرده تا مخلوط گردد سپس آن را به مدت ۱۰ دقیقه در حرارت ۶۵ درجه قرار می دهیم.
به نمونه ۶۰۰ میکرولیتر کلروفرم و۲۵۰ میکرولیتر بافر D اضافه نموده و ۲۰ بار سر و ته کرده و به مدت ۱۰ دقیقه روی شیکر با دور ۲ قرار داده.
نمونه را با دور xg 1000 به مدت ۲ دقیقه سانتریفویژ کرده سه تشکیل می شود ۷۵۰ میکرولیتر از فاز روی را به آرامی برداشته و به میکروتیوپ جدید انتقال داده.
به میکروتیوپ ۷۰۰ میکرولیتر الکل مطلق اضافه نموده و به مدت ۱۰ دقیقه در فریزر قرار داده و سپس با دور xg 10000 به مدت ۴ دقیقه سانتریفویژ کرده محلول روی را به آرامی دور ریخته تا رسوب از ته میکروتیوپ جدا نگردد.
به رسوب حاصل ۱۰۰۰ میکرولیتر الکل ۷۵% اضافه نموده . نمونه را با دور xg 10000 به مدت ۳ دقیقه سانتریفویژ کرده محلول رویی را به آرامی دور ریخته.
میکروتیوپ را به طور برعکس روی دستمال کاغذی قرار داده تا الکل آن تبخیر گردد.
مقدار ۳۰ میکرولیتر آب استریل به میکروتیوپ اضافه کرده.
نمونه را به مدت ۳۰ دقیقه در شرایط آزمایشگاه قرار داده تا DNA به صورت محلول درآید سپس آن را برای آزمایشات بعدی در فریزر نگه داری می کنیم.
۲-۴ : تکنیک PCR:
در این مطالعه توالی ژن AGT در اگزون ۲ که در محدودۀ ۴۲۶۶ تا ۴۶۱۹ قرار دارد و حاوی ۳۵۳ نوکلئوتید است را توسط یک جفت پرایمر زیر تکثیر می کنیم.

دانلود متن کامل پایان نامه در سایت jemo.ir موجود است